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分光光度計析譜詳細講解
發布時間:2018-08-30 點擊次數:568次

分光光度計已經成為現代分子生物學實驗室儀器。常用于核酸、蛋白質定量以及細菌生長的濃度。分光光度計分光光度計的簡單原理和一個可以產生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而導致特定波長的光源,光源透過測試的樣品,部分光源被吸收,計算樣品的吸光度值,轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。核酸定量核酸定量分光光度計是頻繁使用的功能。可以溶解在緩沖定量寡核苷酸單鏈和雙鏈DNA,RNA。核酸的吸收,吸收峰波長260 nm。每一個核酸分子是不同的,所以轉換因子是不同的。不同類型的核酸定量,之前選擇相應的系數。如:1 od的吸光度值50μg 毫升dsDNA,37 ssDNA毫升、40μg 毫升的RNA,30畝Olig g 毫升。后測試后的吸光度值轉換系數,從而得出相應的樣品濃度。在測試前,選擇正確的程序,輸入,和稀釋劑的體積,然后測試空白和樣品液體。然而,實驗并非一帆風順。閱讀不穩定可能是實驗者頭痛的問題。儀器的靈敏度越高,顯示的吸光度值漂移。事實上,分光光度計的設計原理和工作原理,使吸光度值在一定范圍內變化,儀器有一定的準確度和精密度。如EppendorfBiophotometer精度1.0 ?少r(1 a)所以很多變化之間的測試結果平均約1.0 ?是正常的。此外,還需要考慮物理化學性質和核酸本身溶解核酸緩沖pH值,離子濃度,如:在測試中,離子濃度過高,也會導致讀數漂移,因此推薦使用pH值必須降低緩沖,離子濃度,如TE,可以極大地穩定的讀數。稀釋濃度的樣品也是不容忽視的因素:因為不可避免地有一些微小粒子的樣本,尤其是核酸樣本。這些小顆粒的存在干擾的測試結果。粒子,以減少對測試結果的影響,為核酸吸收值大于0.1,至少吸光度值在0.1 - -1.5 -的。在這個范圍內,粒子的干擾相對較小,結果是穩定的。這意味著樣品的濃度不能過高或過低(比光度測試范圍)。后操作因素,如充分混合,否則吸光度值太低,甚至消極;液體混合物不可能存在泡沫,空白沒有暫停,或嚴重的讀數漂移;必須使用相同的顏色杯測試流體和空白樣品,否則濃度差太大,選擇比例因子和樣品濃度單位一致;不能用窗口穿比色杯,樣品的體積必須滿足的要求比色杯的小體積,和其他操作項目。除了核酸濃度、分光光度計和顯示幾個非常重要的比率表示樣品的純度,如260 280的比率,用于評估樣品的純度,因為蛋白質吸收峰是280海里。純樣品,比大于1.8(DNA)或2.0(RNA)。如果這個比率低于1.8或2.0,顯示了蛋白質或酚醛樹脂的影響。230表示樣品的一些污染物,如碳水化合物、多肽、苯酚等純核酸260 230比大于2.0。320年的一項解決方案的濁度和其他干擾因素。純樣品,320年一般是0。蛋白質定量方法(紫外)這種方法直接在280 nm波長,直接測試蛋白質。華寶選擇公式,光度計可以直接顯示樣品的濃度,或者是選擇相應的轉換方法,吸光度值到樣品濃度。蛋白質測定的過程非常簡單,首先空白測試液體,然后直接測試蛋白質。由于有一些雜質在緩沖,一般想要消除\ \ \u201C背景\ \ \u201D信息320 nm,設置這個功能\ \ \ \ \ \u201D。類似于核酸測試,這就需要至少280的吸光度值超過0.1,1.0到1.5之間的線性范圍。根據樣品濃度選擇華寶實驗公式,發現閱讀\ \ \u201C漂移\ \ \u201D。這是一個正常現象。事實上,只要吸光度值的變化觀察到280范圍小于1 ?顯示,結果是非常穩定的。漂移的轉換公式因為華寶吸光度值濃度,乘以一定的系數,只要有一個小變化,吸光度值濃度可以被放大,因此結果不是很穩定。蛋白質定量方法直接,適用于測試比純,相對于一個單一的蛋白質。紫外線直接比色法,定量的方法是快速、操作簡單,但平行材料易受干擾,如DNA的干擾;其他蛋白質含量低的靈敏度更高。比色法定量蛋白質蛋白質通常是多種化合物,是比色法的基礎來確定蛋白質成分:氨基酸(如。、酪氨酸、絲氨酸),加上地下室或染料反應,生成有色物質。有色物質濃度直接相關的氨基酸蛋白質反應,因此反應蛋白濃度。比色法在BCA,布拉德福德,洛瑞,等幾種方法。洛瑞方法:早的雙縮脲反應的基礎上,改進。蛋白質與Cu2 +反應,產生藍色的反應物。但與雙縮脲相比,洛瑞方法靈敏度較高。缺陷是需要訂單輸入不同的反應試劑,反應需要的時間較長,易受影響的非蛋白物質;包含EDTA,特里同x - 100,硫酸氨物質,如蛋白質是不適合這種方法。BCA(Bicinchoninine酸試驗)方法:這是一個相對較新的和更敏感的蛋白質測試。分析蛋白質在堿性溶液中反應,Cu2 +銅+ BCA后者形成螯合,形成紫色化合物,吸收峰波長562納米。這種化合物與蛋白質濃度極強,反應之間的線性關系后化合物的形成是非常穩定的。相對于洛瑞的方法,操作簡單,靈敏度高。但如果與勞里之間方法容易受到干擾蛋白質和洗滌劑。布拉德福德法:這種方法的原理是與考馬斯亮藍反應蛋白質相結合,生成有色化合物的吸收峰595海里。其大的特點是,靈敏度好,兩個測試方法是洛瑞,BCA 2倍;操作更簡單、更快,只需要一個反應試劑;化合物可以穩定1小時,方便結果;一系列干擾Lowry,BCA還原劑的反應(如。、德勤、巰基乙醇)兼容的。但對洗滌劑仍敏感。的主要缺點是不同的標準將導致相同的樣本差異的結果,沒有可比性。一些研究人員為比色法的測定可能各種各樣的比色法測量結果是不一致的,讓人困惑,真的應該相信什么方法嗎?由于各種方法反應組和顯示不同的基組,所以與此同時,幾種方法用于相同的樣本的樣本濃度沒有可比性。凱勒等,例如,測試人類的牛奶蛋白,結果洛瑞,BCA測量濃度明顯高于布拉德福德的顯著差異。即使相同的樣本,同樣的比色方法的選擇標準樣品,測試后的濃度也不同意。如果用洛瑞測試細胞勻漿蛋白,與BSA作為標準,的濃度\ 1.34毫克/毫升,球蛋白作為標準,2.64毫克\ /毫升的濃度。在選擇比色法,因此,的指的是測試樣品的化學成分,尋找相似的化學成分標準蛋白質作為標準。此外,比色法定量蛋白質,經常出現吸光度值問題是樣本過低,導致測量的濃度樣品濃度與實際差距較大。關鍵問題是,反應后的顏色有一個半衰期,因此每個比色法列出了反應測試時間,所有的樣品(包括標準樣品),必須在測試。時間太長,吸光度值小,密度減少的轉換。此外,反應溫度、溶液的PH值等是重要的影響因素的實驗。此外,它是非常重要的,使用塑料比色法。避免使用石英或玻璃杯子的顏色,因為顏色反應后,可以讓一個石英或彩色玻璃,并導致樣品吸光度值不準確。細菌細胞密度(OD)600實驗室,以確定細菌生長密度和生長時期,更多的視覺推理根據經驗和細菌的生長密度。在實驗中,高需求需要一個分光光度計測定細菌細胞的密度。OD600是標準的跟蹤方法在液體培養微生物的增長。后沒有真菌液體培養空白,后定量文化包含細菌培養。為了確保正確操作,每個儀器都必須為每個微生物和細胞計數用顯微鏡,制作校準曲線。偶爾出現在細菌的OD值實驗液體負面,原因是使用了顯色培養基,即細菌培養一段時間后,和反應介質,顏色反應。此外,重要的是要注意,測試樣品可以不離心,使細菌懸浮狀態。重要的配件u2014u2014分光光度計比色杯比色杯根據材料分為石英玻璃,和塑料杯。根據不同的測量體積,比色杯和毛細管比色杯,etc.General試驗定量蛋白質、核酸和紫外線采用石英玻璃或一些,但不適合比色法。因為染料的反應(如。考馬斯亮藍)可以使石英和玻璃著色,所以必須使用一次性塑料杯。和塑料杯不應使用一般的紫外線范圍測試樣品。由于測試樣品數量是不同的,所以一般分光光度計制造商提供不同的體積比色杯,以滿足不同用戶的需求。已經存在一種可用于市場目前,uv定量蛋白質、核酸比色法也可以用于蛋白質測定塑料杯,劑量的樣品只有50μl,比色杯單一的無菌包裝,樣品可以回收。如埃普多夫UVette嗎?塑料比色杯,是一個比色杯的市場創新。隨著生命科學及相關學科的發展,這類的科學實驗和研究提出了更高的要求,分光光度計的分子生物學實驗室將是必不可少的工具,也成為了微生物學,食品,醫藥和其他相關實驗室的一個必要的設備。

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